Le aree specialistiche tradizionali
Biochimica clinica In questa area è inclusa la maggior parte delle analisi di più frequente esecuzione, in quanto legate a patologie che hanno una grande diffusione nella popolazione, e per le quali vi è stata, in relazione alla utilità, una forte spinta all’esecuzione già molti decenni fa. Il miglioramento delle tecnologie analitiche ha consentito negli ultimi trent’anni, oltre che un enorme miglioramento della qualità delle analisi, anche una notevole estensione dello spettro delle analisi eseguibili. Substrati, enzimi, proteine L'equilibrio idro-elettrolitico è uno dei prerequisiti fondamentali per garantire il funzionamento delle cellule e dei tessuti. Fanno parte delle analisi di base di biochimica clinica le determinazioni nel siero degli elettroliti sodio, potassio e cloruro (Na+, K+, Cl-) come pure le determinazioni di alcuni ioni che regolano le attività cellulari, come il calcio ionizzato (Ca++), e lo ione fosfato (H2PO4- e HPO4--), che entra in equilibrio con il calcio totale del siero ad alimentare la costituzione del tessuto osseo, tessuto che, contrariamente a quanto si pensava in passato e in genere si immagina, è soggetto ad un ricambio (turnover) elevato. Le determinazioni di pH e dei gas del sangue ottenute mediante emogasanalisi, sono legate soprattutto a situazioni di urgenza medica, visto che in condizioni normali l'organismo possiede risorse veramente importanti per regolarne le concentrazioni, che sono come ovvio assolutamente vitali. Tra le analisi più frequentemente eseguite vi sono la determinazione del glucosio nel siero o nel plasma (la malattia diabetica colpisce nel mondo oltre 300 milioni di persone), e del glucosio nelle urine, delle proteine totali nel siero e nelle urine (con le quali le proteine possono essere perse in seguito e lesioni renali, principalmente per perdita della frazione principale, l'albumina), la determinazione dell'acido urico (legata al disordine del metabolismo delle purine che porta alla gotta), l'urea e la creatinina nel siero (innalzamento nell'insufficienza renale, essendo peraltro l'urea meno significativa della creatinina, che rappresenta il vero indicatore del grado di insufficienza renale), la bilirubina nel siero (iperprodotta, e quindi quali esclusivamente nella forma indiretta, nel caso di anemie emolitiche, non eliminata, e quindi quasi esclusivanmente nella forma diretta nel caso di ostruzione delle vie biliari, in un rapporto variabile ma più bilanciato nel caso di epatite) Pensando alle malattie cardiovascolari, che hanno nell'aumento della concentrazione del colesterolo totale nel siero un fondamentale fattore di rischio, non vanno dimenticati le sue frazioni colesterolo HDL e il colesterolo LDL, i trigliceridi, l'apolipoproteina AI e l'apolipoproteina B. Nelle anemie, la patologia ematologica più frequente, la determinazione del ferro, della transferrina e della ferritina si complementano tra loro e complementano in modo insostituibile i risultati dell'esame ematologico più importante, l'esame emocromocitometrico (mentre le determinazioni della capacità totale di legare il ferro (TIBC) e della capacità latente di legare il ferro (LIBC) sono ormai da considerarsi obsolete). L'elettroforesi delle proteine del siero ha ormai importanza solo come metodo per lo screening delle componenti monoclonali, da confermare mediante immunofissazione (cha ha sostituito l'ormai osboleta immunoelettroforesi). Per il monitoraggio di una componente monoclonale di rilevante entità (superiore ai 0,30,5 g/dL) viene eseguita l'elettroforesi e quindi la componente viene determinata in base alle proteine totali e alla precentuale che essa rappresenta nel tracciato elettroforetico. Negli stati infiammatori le proteine della fase acuta [come l'alfa-1-glicoproteina acida e la proteina C reattiva (PCR)] affiancano la VES consentendo, sulla base delle differenza nelle loro emivite, di differenziare una flogosi acuta da una in via di risoluzione. Nella categoria dei marcatori della necrosi cellulare si va dalle tradizionali transaminasi (AST o GOT e ALT o GPT), le cui concentrazioni più elevate sono legate a distruzione degli epatociti in seguito ad epatite (virale o tossica), ma che aumentano anche in caso di infarto del miocardio, alla lattato deidrogenasi (LDH) e alla creatina chinasi (CK), purtroppo poco specifiche, e meglio sostituite nel caso dell'infarto del miocardio dalla CK-MB (isoenzima specifico del muscolo cardiaco), dalla mioglobina e dalla troponina I e dalla troponina T (sostanzialmente equivalenti tra di loro, e per questo utilizzabili in alternativa). Tornando all'epatite, agli enzimi va affiancata come detto in precedenza la bilirubina. Nelle pancreatiti hanno importanza diaglostica l'alfa-amilasi e la lipasi. Ormoni Sono suddivisi in tre classi principali: ormoni steroidei (liposolubili, circolano legati a proteine di trasporto ed esercitano la loro azione legandosi a recettori citoplasmatici, hanno una emivita compresa tra i 60 del testosterone e i 100 minuti del cortisolo), ormoni proteici o polipeptidici (generalmente idrosolubili, si ritrovano in circolo in forma libera, i loro recettori sono localizzati sulla membrana cellulare mentre la loro emivita varia da 5 a 60 minuti) e ormoni amminoacidici (che hanno caratteristiche molto diverse tra di loro: il T4, ad esempio, circola legato a 3 diverse proteine di trasporto ed ha una emivita di una settimana, mentre l’adrenalina non ha proteine di trasporto ed ha una emivita di meno di un minuto). Gli ormoni ipotalamici regolano la sintesi e la secrezione degli ormoni ipofisari mediante fattori stimolanti (releasing factors) o fattori inibenti (inhibiting factors). I principali fattori stimolatori sono il GH-RH che stimola la secrezione di GH, il TRH che stimola la secrezione di TSH, il CRH che stimola la secrezione di ACTH, il GnRH che stimola la produzione di gonadotropine mentre i principali fattori inibenti sono la somatostatina per il GH e la dopamina per la prolattina. Gli ormoni ipotalamici sono, a loro volta sotto il controllo sia degli ormoni secreti dalle ghiandole periferiche che degli ormoni ipofisari (short-feedback), esiste inoltre un autocontrollo esercitato dagli ormoni ipotalamici su se stessi (ultra-short feedback). Gli ormoni prodotti dall’ipofisi esercitano principalmente la loro azione su altre ghiandole endocrine:→ il TSH stimola la produzione degli ormoni tiroidei aumentando la produzione di AMP-ciclico a livello delle cellule follicolari della tiroide;→ l’ACTH, sintetizzato a partire dalla pro-opiomelanocortina, regola la secrezione degli ormoni steroidei prodotti dalla corteccia surrenale, in particolare il cortisolo. Ha una secrezione che raggiunge il massimo nelle prime ore del mattino ed un minimo in serata. Lo stress un importante stimolo per quest’ormone;→ le gonadotropine (LH e FSH) stimolano, nell’adulto, sia uomo sia donna, la produzione di ormoni gonadici e la gametogenesi. I livelli circolanti variano grandemente con l’età e nella donna in età feconda presentano un tipico andamento ciclico nelle diverse fasi del ciclo mestruale. Questi ormoni subiscono poi un netto incremento in coincidenza della menopausa per la caduta degli estrogeni circolanti;→ l’ormone della crescita (GH) svolge una funzione stimolatoria sulle cartilagini di accrescimento, azione mediata dalla somatomedina, peptide prodotto a livello epatico. Possiede un effetto anabolizzante agendo sul metabolismo lipidico, glucidico e proteico. Viene secreto prevalentemente di notte circa un’ora dopo l’inizio del sonno profondo;→ la prolattina è sotto controllo inibitorio dopaminergico da parte dell’ipofisi, è stimolata da estrogeni, TRH e stress. Raggiunge i valori più elevati nel corso delle ultime ore di sonno. Aumenta notevolmente durante la gravidanza. Agisce inducendo e mantenendo la lattazione. Un suo aumento patologico è alla base di numerosi casi di amenorrea nonché di infertilità sia maschile sia femminile. Gli ormoni tiroidei, rispettivamente T3 (tiroxina) e T4 (triiodotironina), la cui sintesi e secrezione è regolata dal TSH, si ritrovano in circolo in piccola parte come frazione libera ed in gran parte legati a proteine di trasporto come la thyroid binding globulin (TBG) e l’albumina. Gli ormoni tiroidei esercitano la loro azione praticamente a livello di tutti gli organi e tessuti. Stimolano il consumo di ossigeno e la sintesi enzimatica, intervengono sul metabolismo glucidico modulando l’azione di insulina e catecolammine. Stimolano praticamente tutti gli aspetti del metabolismo lipidico, aumentano il fabbisogno delle vitamine idrosolubili. Nell’ipotiroidismo si può avere aumento di beta-carotene con manifestazioni cliniche di deficit di vitamina A. Le paratiroidi producono il paratormone (PTH) che, insieme a calcitonina e vitamina D, controlla l’omeostasi del calcio. Gli organi bersaglio del PTH sono il tessuto osseo e l’apparato renale. Il paratormone stimola il riassorbimento osseo agendo sull’osteoblasto e, a livello renale, aumentando il riassorbimento del calcio nel tubulo distale e riducendo quello di fosforo in quello prossimale. I prodotti della corticale del surrene (più parte più esterna del surrene, che rappresenta circa l’80% della ghiandola,) si possono distinguere in due diverse categorie: i glucocorticoidi, che hanno come principale rappresentante il cortisolo, e i mineralcorticoidi rappresentati dall’aldosterone. La secrezione del cortisolo, direttamente controllata dall’ACTH, segue un tipico ritmo circadiano raggiungendo un massimo poco dopo il risveglio ed un minimo intorno alla mezzanotte. Il cortisolo in circolo viene veicolato da una proteina la transcortina. Altro importante fattore di regolazione è lo stress (traumi, pirogeni, ipoglicemia, stati d’ansia) che, attraverso un rapido aumento dell’ACTH, provoca un innalzamento della concentrazione del cortisolo. I glucocorticoidi agiscono aumentando i livelli circolanti di glucosio, stimolando il catabolismo proteico, hanno un forte effetto inibitorio sull’ACTH , in concentrazione soprafisiologica inibiscono le reazioni infiammatorie ed allergiche, inoltre stimolano l’emopoiesi e l’appetito mentre riducono gli eosinofili circolanti. I mineralcorticoidi provocano un incremento dei livelli di sodio ed una diminuzione di quelli di potassio. Un eccesso di mineralcorticoidi provoca edema ed ipertensione. La midollare del surrene (la parte più interna del surrene, formata da tessuto cromaffine strettamente correlata al sistema nervoso autonomo) produce catecolammine ed in particolare adrenalina, noradrenalina e dopamina. La loro secrezione è regolata principalmente da stimoli nervosi provenenti dai centri ipotalamici. La loro azione si esplica su molti organi e tessuti che presentano adrenorecettori: cuore, muscolo liscio, tessuto adiposo, eccetera). Nell’ovaio in età fertile si hanno modificazioni cicliche legate al ciclo mestruale che comprendono le variazioni che avvengono a livello di sistema nervoso centrale, anteroipofisi, ovaio e utero. Nella prima fase del ciclo (fase follicolare) si assiste, in presenza di concentrazioni basali di estrogeni, alla maturazione del follicolo dominante sotto il controllo delle gonadotropine, in particolare l’FSH, secrete in modo pulsatile (picchi ogni 60-90 minuti). Durante la fase follicolare intermedia la secrezione di inibina da parte del follicolo rallenta la secrezione di FSH. Nella fase follicolare tardiva il rapido aumento di estrogeni, mediante un meccanismo di feedback positivo, stimola la secrezione di LH. Contemporaneamente l’aumento del progesterone stimola la secrezione di LH e FSH. A metà ciclo avviene l’ovulazione, LH e FSH raggiungono la massima concentrazione. Nella fase luteinica precoce il progesterone prodotto dal corpo luteo inibisce la secrezione di LH. Successivamente, la caduta del progesterone provoca un aumento dell’FSH che da avvio ad una nuova fase follicolare. L’attività endocrina del testicolo si svolge, regolata dalle gonadotropine, a livello delle cellule del Leydig e, in misura minore, nelle cellule del Sertoli. Il testosterone è il più importante androgeno prodotto dalle cellule di Leydig, circa il 2% dell’ormone è in circolo in forma libera mentre il rimanente 98% è legato a proteine di trasporto tra cui la più importante è la sex hormone binding globulin (SHBG). Il testicolo produce anche androstenedione, importante precursore degli estrogeni, 17-idrossiprogesterone e progesterone. Le cellule del Sertoli sintetizzano inibina, un ormone polipeptidico che possiede un’azione inibitoria sulla secrezione ipofisaria di FSH. Nel feto gli androgeni inducono la formazione del fenotipo maschile, nell’adolescente, alla pubertà, determinano lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari, intervengono anche nell’accrescimento scheletrico e nella sviluppo muscolare; nell’adulto inducono la spermatogenesi e mantengono la funzione sessuale. Il pancreas endocrino è formato dalle isole del Langerhans e costituisce l’1-3% dell’intero organo. Le isole sono costituite da cellule di 4 tipi istochimici diversi che secernono diversi tipi di ormoni: le cellule a producono glucagone, le cellule b producono insulina, le cellule d producono somatostatina e le cellule F producono il polipeptide pancreatico. Il più importante di questi ormoni è l’insulina che viene prodotta come pro-insulina costituita da una singola catena aminoacidica, che per clivaggio enzimatico si libera del peptide di connessione (C-peptide) dando origine all’insulina. L’ormone agisce sui tessuti bersaglio tramite un recettore specifico provocando effetti diversi a seconda del tessuto: a livello muscolare favorisce la sintesi di glicogeno, di proteine e di acidi nucleici, stimola la glicolisi e la formazione di piruvato; nel tessuto adiposo favorisce la sintesi dei trigliceridi e inibisce la lipolisi.; a livello epatico promuove la glicolisi e aumenta la sintesi di glicogeno, di lipidi e proteine, inibisce la proteolisi e la lipolisi, limita la gluconeogenesi e la chetogenesi. Il glucagone esplica un’azione iperglicemizzante opposta all’insulina. La somatostatina ha un effetto inibitorio locale sulla secrezione degli altri ormoni pancreatici e gastroenterici in generale. La pressione arteriosa e l’omeostasi elettrolitica sono sotto il controllo endocrino del sistema renina-angiotensina-aldosterone. La renina è un enzima proteolitico prodotto, a livello renale, dalle cellule iuxtaglomerulari. La renina agisce sull’angiotensinogeno epatico trasformandolo in angiotensina I, questa a sua volta viene trasformata in un octapeptide attivo l’angiotensina II ad opera dell’angiotensin converting enzyme (ACE) prodotto a livello polmonare. L’angiotensina attiva favorisce la contrazione della muscolatura liscia delle arteriole, stimola la produzione di aldosterone e provoca un aumento della volemia. Marcatori tumorali È noto da tempo che le cellule neoplastiche, a causa dell'alterazione di alcuni processi di crescita e di metabolismo, producono sostanze che si possono ritrovare nel sangue, e genericamente denominate marcatori tumorali. Dal punto di vista delle caratteristiche biochimiche-biologiche i marcatori tumorali possono essere rappresentati da:→ enzimi/isoenzimi [fosfatasi acida prostatica (PAP), enolasi neurone specifica (NSE)], fosfatasi alcalina, antigene prostatico specifico (PSA);→ ormoni/subunità ormonali [gonadotropina corionica umana (HCG), calcitonina, tireoglobulina (Tg)];→ prodotti di differenziazione [poliamine, acidi sialici, ferritina, beta-microglobulina];→ molecole di adesione [antigene carcinoembrionario (CEA)];→ molecole di trasporto [alfa-fetoproteina (AFP)];→ citocheratine [antigene polipeptidico tissutale (TPA), Cynail.l, TPS, TPAcyc];→ mucine {marcatori tumorali identificati con anticorpi monoclonali. Sono i marcatori tumorali appartenenti alla serie dei CA (Cancer Antigen come CA19.9, CA125, CA15.3) caratterizzata da epitopi espressi dalla numerosa famiglia delle mucine ed identificati rispettivamente con l'anticorpo monoclonale NS19, OC125, 115D8 e DF3, e altri. Le mucine sono particolari glicoproteine che rivestono la superficie degli epiteli formando il gel mucoso responsabile della protezione fisiologica contro microrganismi, sostanze tossiche, agenti fisici e variazioni di pH. Tali sostanze sono state identificate anche sulla superficie di cellule non epiteliali o comunque di cellule non deputate alla secrezione. Tali molecole vengono normalmente secrete dall'epitelio ghiandolare dei tratti gastrointestinale, respiratorio e urogenitale, e costituiscono la componente principale del muco];→ marcatori associati a modificazioni genetiche del tumore [prodotti di oncogeni e geni oncosoppressori]. Pur rimanendo per ora nell'ambito della ricerca, rappresentano un'importante prospettiva di indirizzo;→ cellule tumorali circolanti. Anche questi come i precedenti, pur rimanendo per ora nell'ambito della ricerca, rappresentano un'importante prospettiva di indirizzo. Immunologia Il sistema immunitario ha come scopo principale quello di mantenere l'omeostasi dell'organismo in collaborazione con altri sistemi quali il sistema endocrino e quello nervoso. Tale obbiettivo viene perseguito attraverso la capacità di discriminare tra ciò che è sé da ciò che è diverso dal sé, capacità che lo rende adatto a difendere l'individuo dall'attacco di microrganismi, sostanze estranee (antigeni) e dall’insorgenza di neoplasie. Questa funzione viene svolta da due sistemi integrati, l'immunità naturale e l'immunità acquisita (o specifica), che collaborano all'eliminazione degli elementi riconosciuti come diversi dal sé. Autoimmunità Le patologie autoimmuni sono il risultato di una perdita della tolleranza immunitaria verso antigeni autologhi, con l’emergenza di cloni di linfociti T autoreattivi, che si manifesta con la sintesi da parte dei linfociti B di (auto)anticorpi diretti verso costituenti dell'organismo (autoantigeni). Esistono numerosissime strutture che possono divenire bersaglio di questa anormale risposta immunitaria. Queste possono essere localizzate esclusivamente o principalmente in un determinato organo o tessuto, oppure essere diretti verso antigeni ubiquitari. Nel primo caso si ha una malattia organo-specifica che si manifesta generalmente con una ipo-funzione o una iper-funzione dell’organo bersaglio, nel secondo caso invece l’alterata risposta immune dà luogo ad una malattia sistemica. Questa classificazione schematizza una situazione in realtà caratterizzata da uno spettro continuo di patologie autoimmuni al cui interno troviamo forme con caratteristiche intermedie tra quelle organo specifiche e quelle sistemiche, come ad es. la cirrosi biliare primitiva, patologia localizzata ma con anticorpi diretti verso antigeni ubiquitari. A livello sierologico le malattie autoimmuni sono quindi caratterizzate dalla presenza di autoanticorpi, che rivestono un particolare valore diagnostico e in alcune situazioni sono utili parametri di monitoraggio della malattia. Allergologia Le patologie allergiche sono il risultato di una risposta immunitaria diretta verso sostanze presenti nell'ambiente (allergeni) e "normalmente" non immunogene, che provoca una reazione infiammatoria. L'insorgenza della patologia allergica è sotto il controllo di più geni, non ancora del tutto noti, che in particolari soggetti determinano uno sbilanciamento della risposta immunitaria verso la sintesi delle IgE. Le manifestazioni allergiche, che conseguono a questa risposta immunitaria, sono il risultato del rilascio di numerosi mediatori solubili preformati e di nuova sintesi da parte di basofili, eosinofili e mastociti, cellule principalmente coinvolte nelle reazioni allergiche immediate o IgE-mediate. Tali reazioni determinano quadri clinici di variabile gravità e sede comprendenti congiuntivite, rinite, asma, orticaria, angioedema, shock anafilattico. Gli allergeni più frequentemente responsabili di tali manifestazioni sono gli allergeni inalanti, gli allergeni alimentari e i farmaci. Tra le analisi allergologiche le due fondamentali sono rappresentate dalla determinazione quantitativa delle IgE totali e dalla determinazione quantitativa delle IgE specifiche per i diversi allergeni disponibili. Nella tabella ho riportato un elenco molto completo di allergeni nei confronti dei quali è possibile effettuare dalla determinazione quantitativa delle IgE specifiche (l’elenco è molto completo ma anche molto vasto, e per questa ragione in genere in uno specifico laboratorio è disponibile solo parte degli allergeni elencati). Xenobiotici Sono letteralmente sostanze estranee che hanno importanza diagnostica in quanto somministrate a scopo terapeutico (farmaci), soggette ad abuso (droghe), o di importanza tossicologica. Monitoraggio terapeutico dei farmaci In caso di malattia, la somministrazione dei farmaci viene effettuata applicando sistematicamente regole posologiche specifiche per ciascun farmaco, e che il medico curante, sulla base delle conoscenze farmacologiche che gli sono peculiari, è in grado di modulare opportunamente sulla base della gravità della malattie e delle caratteristiche individuali (pazienti in età pediatrica, pazienti con insufficienza renale, pazienti anziani, eccetera). Tuttavia in alcuni casi, in particolare per alcuni farmaci con un ridotto indice terapeutico, per i quali cioè la dose terapeutica è molto vicina alla dose che incomincia ad esplicare effetti tossici, al fine di raggiungere e mantenere nel sangue del paziente la concentrazione terapeutica appropriata il medico si serve del dosaggio del farmaco nel sangue. Questo è particolarmente vero per i farmaci anticonvulsivanti, utilizzati per il controllo delle crisi epilettiche, per i farmaci digitalici (che aumentano la forza di contrazione del muscolo cardiaco, e sono quindi utilizzati nell'insufficienza cardiaca), per i broncodilatatori (utilizzati per il controllo delle crisi asmatiche), per alcuni antidepressivi (tipicamente il litio). Droghe d'abuso L'importanza del dosaggio delle droghe d'abuso è legata prevalentemente a problemi di tipo medico legale, sia di tipo preventivo, in particolari classi di lavoratori (piloti d'aereo per esempio), sia a posteriori (incidenti stradali, eccetera), ovvero a problemi di pronto soccorso (pazienti in coma). Oggi è possibile disporre, nei centri avanzati, di metodiche di cromatografia liquida (HPLC) in grado di determinare contemporaneamente su un solo campione di sangue 400500 tra droghe e loro metaboliti (tetraidrocannabinolo, morfina, eroina, cocaina e loro metaboliti, benzodiazepine, barbiturici, allucinogeni come LSD ed ecstasy, eccetera) Indagini tossicologiche Le indagini tossicologiche sono eseguite pressochè esclusivamente in seguito ad esigenze provenienti dalla Medicina del Lavoro. Questa attualmente basa la sua politica di intervento e la sua efficacia piuttosto che sulla misura a posteriori della concentrazione delle sostanze potenzialmente nocive nel sangue e nelle urine dei lavoratori, sulla prevenzione: realizzata sulla base di un’accurata conoscenza dei processi produttivi, e sulla messa in atto di tutti i meccanismi di protezione dei lavoratori, inclusa la formazione del lavoratore al rispetto scrupoloso delle procedure messe in atto per la tutela della sua salute. Per questo motivo il numero di analisi che si rendono necessarie risulta enormemente inferiore a quanto ci si aspetterebbe. Nonostante la valorizzazione dell'aspetto preventivo su quello curativo, in numerosi casi risulta peraltro necessario procedere a valutazioni periodiche della concentrazione di sostanze potenzialmente dannose in soggetti professionalmente esposti, per verificare che le procedure di prevenzione stanno fornendo i risultati attesi in termini di protezione del lavoratore dal rischio. Ematologia In questa area si sono andate aggregando le discipline che studiano il sangue come peculiare tessuto dell’organismo, un “tessuto liquido” con caratteristiche morfologiche e funzionali legate alle diverse specializzazioni della sua parte corpuscolata (le cellule del sangue), alle esigenze di trovare un equilibrio tra l’esigenza di mantenersi liquido e quella di impedire i fenomeni emorragici, e alle conseguenze immunologiche del suo eventuale entrare in contatto con cellule del sangue estranee (come per esempio cellule del sangue del feto che entrano nel circolo materno). Ematologia L’introduzione dei metodi automatici di analisi cellulare ha radicalmente trasformato la realtà operativa del laboratorio di ematologia. Oggi l'esame emocromocitometrico è ancora l’analisi in assoluto più richiesta, e fornisce, con misurazioni quantitative dirette e gli indici da esse derivati, informazioni sia sul numero sia sulle caratteristiche significative di globuli rossi, leucociti e piastrine. Coagulazione L’analisi di questa area in assoluto più richiesta dopo l’esame emocromocitometrico è il tempo di protrombina: questa viene trattata in dettaglio, con tutte le analisi pertinenti, nell’ambito della seconda suddivisione dell’area, rappresentata dalla coagulazione. E’ importante notare che tutte le varie funzioni del sangue sono legate al suo stato fluido, connesso a sua volta al movimento; il trasporto di acqua, ossigeno, anidride carbonica, metaboliti ed ormoni, come quello delle cellule deputate alla difesa da aenti estranei (leucociti), è appunto assicurato dal passaggio del sangue attraverso i polmoni, gli organi e i tessuti del corpo. Per poter svolgere tutte le sue funzioni, il sangue deve quindi poter circolare nei vasi allo stato liquido. A causa di un danno vascolare esso può subire un cambiamento dello stato chimico-fisico, con conseguente attivazione enzimatica e passaggio dallo stato fluido allo stato “solido”, attraverso il processo di coagulazione. Quando il coagulo di fibrina ha terminato la sua funzione di “tappo” emostatico, si riattivano reazioni enzimatiche che riportano il sangue allo stato fluido ed alla risoluzione del danno parietale. Immunoematologia Infine la terza suddivisione dei questa area, l’immunoematologia, nasce sull’onda della necessità di intervenire, in casi estremi, ripristinando la massa sanguigna di un malato o suoi singoli componenti (eritrociti, piastrine, o singole componenti del sistema coagulativo) mediante la trasfusione di sangue proveniente da un donatore sano. E ancora una volta, con la determinazione di gruppi sanguigni e test di Coombs, il laboratorio si dimostra in grado di fornire strumenti fondamentali per una gestione efficace dei problemi che il clinico deve affrontare quotidianamente. Microbiologia Sono stati i problemi causati della malattie infettive a innescare la spinta che ha portato allo sviluppo della microbiologia, inizialmente focalizzata sui batteri, e che ha successivamente inglobato, sulla base delle scoperte che si sono succedute nel tempo, tutti gli altri organismi in grado di determinare patologie, cioè parassiti (mono e pluricellulari) e microrganismi (miceti, rickettsie, chlamydie, micoplasmi, virus). Sierologia infettiva Si basa sul principio per cui in alcuni casi la presenza di un'infezione, oltre che (o invece che) mediante l'evidenziazione diretta dell'agente infettante nei materiali biologici dell'organismo ospite, può essere effettuata indirettamente, evidenziando nel sangue dell'organismo ospite anticorpi specifici per un determinato agente infettante. Nella fase iniziale dell'infezione gli anticorpi prodotti appartengono ad una classe particolare delle immunoglobuline, le IgM. Successivamente, in concomitanza con il processo di guarigione dall'infezione, che in alcuni casi porta ad un’immunità permanente (vedansi ad esempio il morbillo, la rosolia, la varicella, la toxoplasmosi) le IgM vengono sostituite de immunoglobuline appartenenti alla classe delle IgG. Risulta pertanto possibile non solo identificare indirettamente un'infezione dal riscontro nel sangue di anticorpi specifici contro un determinato agente infettante, ma anche distinguere la fase acuta della malattia (caratterizzata dalla presenza di IgM) dalla fase di immunità (più o meno permanente) che segue la malattia, caratterizzata dalla presenza di IgG. A questo va aggiunto che la sierologia infettiva, nel corso degli ultimi decenni, si è arricchita della possibilità di determinare, accanto agli anticorpi, anche antigeni specifici di varie malattie infettive, cioè componenti del microrganismo che, durante la sua replicazione, si liberano nel sangue (valga come esempio l’antigene Australia, denominazione originaria di quello che oggi noto come antigene [Ag] di superficie [s] del virus dell’epatite B [HB], indicato con la sigla HBsAg). A partire dalla classica reazione di Widal, per la diagnosi di tifo e per la diagnosi di paratifo A e B, e dalle reazioni per la sierodiagnosi della lue (VDRL, TPHA, FTA-ABS), antesignane della sierologia infettiva, il laboratorio clinico ha saputo sviluppare nel tempo un numero molto elevato di altri metodi per la determinazione di anticorpi (Ab) specifici per un determinato agente ifettante. La determinazione di Ab anti-toxoplasma, di Ab anti-rosolia, di Ab anti-citomegalovirus e di Ab anti-herpes virus, rappresenta oggi un elemento fondamentale nello screening e nel monitoraggio della gravidanza. Per l'epatite virale di tipo A è disponibile la determinazione degli anticorpi, mentre la diagnostica dell'epatite virale di tipo B e dell'epatite virale di tipo D sono disponibili anche le determinazioni degli antigeni espressi dall'agente infettante. Per l'epatite virale di tipo C, oltre alla determinazione degli anticorpi specifici, è disponibile oggi la determinazione sia qualitativa sia quantitativa, con metodi di biologia molecolare, dell'RNA virale. Alla ricerca degli Ab anti-chlamydia si è oggi affiancata la possibilità di evidenziare (in particolare nelle urine) direttamente il DNA dell'agente infettante, ottenendo sensibilità e specificità di gran lunga maggiori di quelle consentite della tradizionale sierologia. Altre analisi disponibili, da utilizzare in relazione a specifiche esigenze cliniche, sono rappresentate dalle determinazioni di Ab anti-HIV, di Ab anti-tossina tetanica (per valutare la presenza di immunità in seguito a vaccinazione antitetanica), di Ab-anti bordetella (agente eziologico della pertosse). Batteriologia I tre cardini della batteriologia, che si occupa della ricerca dei batteri patogeni ed opportunisti nei materiali biologici, sono costituiti dall’esame batterioscopico, dall’esame colturale e dall'antibiogramma. L’esame batterioscopico prevede la ricerca dei batteri mediante la lettura microscopica. Per ogni campione vengono preparati uno o più vetrini a fresco o colorati con metodi specifici (colorazione di Gram o colorazione di Ziehl Neelsen). La sue esecuzione è ormai limitata a casi specifici, i soli nei quali l'esame batterioscopico è in grado di fornire informazioni adeguate. Per questo in genere l'esame batterioscopico non viene esplicitamente richiesto, ma viene piuttosto eseguito dal laboratorio nei casi appropriati. L’esame colturale prevede inizialmente la semina del materiale biologico in appropriati terreni di crescita, l’incubazione in condizioni idonee alla riproduzione del microrganismo e successivamente l’identificazione e l’antibiogramma dei batteri patogeni ed opportunisti eventualmente presenti. La positività dell’esame colturale viene verificata dopo 24 ore dalla semina del campione in esame (tempo indispensabile per la crescita degli eventuali microrganismi). In alcuni casi particolari occorrono 48 ore prima di per poter iniziare l’identificazione del germe, in quanto una scarsa crescita dello stesso o una coltura mista determinano un ritardo di 24 ore. L’identificazione viene effettuata, per la maggioranza dei microrganismi, con sistemi automatici, che consentono la contemporanea esecuzione di numerosi (fino a 30) test biochimici in 24 ore.. L’identificazione viene considerata valida solo nel caso in cui abbia un livello di affidabilità superiore al 95%. Per quanto riguarda la tipizzazione e l’identificazione degli Streptococchi beta-emolitici sono utilizzati test di agglutinazione con anticorpi specifici. Il test possiede rispettivamente una percentuale di sensibilità e di specificità entrambe del 100% nel caso dei gruppi A, B, C, F e del 96,8% e del 87,5% rispettivamente nel caso del gruppo G. Lo Streptococcus pneumoniae viene tipizzato con anticorpi specifici per gli 83 sierotipi. L’antibiogramma che ha lo scopo di fornire al medico l’indicazione di quali siano gli antibiotici più efficaci nel caso del/i microrganismo/i isolato/i ed identificato/i. L’esecuzione degli antibiogrammi su sistemi automatici in microdiluizione. necessita di 2448 ore. Nei laboratori avanzati i risultati sono calcolati come MIC (concentrazione minima dell'antibiotico in grado di inibire la crescita del germe) e trasformati nelle categorie di Sensibile, Intermedio e Resistente per consentire una più immediata e semplice interpretazione dei risultati dell'antibiogramma da parte del medico. I sistemi automatici moderni per l'esecuzione dell'antibiogramma possiedono un programma esperto incorporato che consente di evidenziare e bloccare pattern di sensibilità insoliti (fenotipi incontrati raramente, resistenze crociate non rispettate, “gerarchia“ di resistenza non rispettata), così da permettere all’operatore di ricontrollare il dato, di rilevare i meccanismi di resistenza, e di individuare eventualmente la correzione terapeutica da adottare in termini di posologia. Nella tabella sono riportati le principali ricerche effettuate di routine per ciascuna indagine. Parassitologia Per le parassitosi intestinali sono ricercati i protozoi e gli elminti nei campioni fecali. Per le parassitosi ematiche (come la malaria) sono esaminati campioni di sangue. Nel caso di parassitosi sistemiche può essere necessario esaminare agoaspirati di linfonodi (toxoplasmosi), agobiopsie del fegato (leishmaniosi) o biopsie di tessuti. Per quanto riguarda gli elminti in genere nelle feci si ritrovano le larve e le uova: ma si possano ritrovare anche vermi adulti o segmenti di essi (per esempio le proglottidi di Tenia). Mentre questi ultimi sono di solito visibili a occhio nudo, i trofozoiti, le cisti, le larve e le uova sono visibili solo al microscopio. Di conseguenza, per poter osservare queste strutture, il materiale fecale viene opportunamente preparato ed esaminato. Per una diagnosi microscopica il più possibile attendibile è consigliabile esaminare almeno tre campioni fecali raccolti a giorni alterni, in quanto l’eliminazione dei parassiti intestinali è spesso discontinua. Per l’identificazione degli elminti (Nematodi, Cestodi, Trematodi) vengono ricercate le usuali forme diagnostiche (uova e larve), più raramente si possono ritrovare vermi adulti quali Ascaris ed Enterobius. Il ritrovamento di proglottidi di Taenia permette la diagnosi di specie. Comunque, nella maggior parte delle infestazioni da elminti la diagnosi viene effettuata per mezzo delle uova. Nei preparati con soluzione fisiologica si possono osservare anche le larve di Strongyloides stercolaris. Per quanto riguarda i protozoi nelle feci si ritrovano i trofozoiti e le cisti. I protozoi che possono parassitare l’intestino umano appartengono a 5 gruppi: amebe, flagellati, ciliati, coccidi e microsporidi. Per quanto riguarda amebe e flagellati, nelle feci si possono ritrovare sia trofozoiti che cisti. I trofozoiti si ritrovano in genere nelle feci diarroiche o liquide, le cisti in quelle formate. Comunque le due forme possono essere presenti nel medesimo campione. Nei preparati con soluzione fisiologica si possono evidenziare trofozoiti e cisti di amebe e flagellati. In feci appena emesse ( non più di un’ora) possono essere visti trofozoiti mobili che vengono identificati utilizzando obiettivi 40x (ingrandimento di 40 diametri). I preparati con soluzione allo iodio permettono di osservare le strutture peculiari all’interno delle cisti che consentono l’identificazione del genere e della specie del protozoo. Micologia La ricerca dei miceti nei materiali biologici prevede la determinazione dei lieviti patogeni (come ad esempio certi ceppi di Candida albicans) e delle muffe patogene. I lieviti, si ricorda, sono miceti unicellulari che si riproducono per gemmazione, mentre le muffe hanno una forma vegetativa più complessa costituita da ife filamentose che costituiscono il micelio. Per quanto riguarda i lieviti l’identificazione di genere e di specie è possibile mediante test in vitro, ed è possibile (ma solo nel caso di infezioni sistemiche) effettuare un antimicogramma comprendente i più comuni antimicotici: flucitosina, anfotericina B, nistatina, miconazolo, econazolo, ketoconazolo. Per quanto riguarda le muffe la determinazione del genere e della specie (ove possibile) viene effettuata mediante caratterizzazioni morfologiche macroscopiche e microscopiche. Attualmente non esistono per le muffe sistemi standardizzati che consentano di effettuare i test di sensibilità agli agenti chemioterapici. Batteriologia molecolare Nel caso di sospetto di infezioni particolari, è possibile ricercare direttamente l'agente infettante mediante rilevazione del suo materia genetico (DNA o RNA) nel materiale biologico inviato o prelevato. Questo consente una sensibilità e una rapidità di rilevazione straordinari: si pensi al caso del bacillo di Koch, agente eziologico della tubercolosi, per l'identificazione del quale, stante la sua crescita assai lenta, erano un tempo necessarie colture della durata fino a 40 giorni ma che, con la rilevazione del suo DNA, può essere individuato in due giorni. ********************************
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Ultimo aggiornamento: 20 febbraio 2023
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